液相色譜分析以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，是以高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過(guò)程。通常所說(shuō)的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于100um 的吸附劑（ 硅膠、氧化鋁等）。這種傳統(tǒng)的液相色譜分析所用的固定相粒度大，傳質(zhì)擴(kuò)散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進(jìn)行簡(jiǎn)單混合物的分離。而液相色譜分析所用的固定相粒度小（5um-10um）、傳質(zhì)快、柱效高。液相色譜分析是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來(lái)的一種分析方法。近年來(lái)，在保健食品功效成分、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測(cè)定等應(yīng)用廣泛。世界上約有80%的有機(jī)化合物可以用HPLC來(lái)分析測(cè)定。

　　液相色譜分析原理

　?。ㄒ唬┮合嗌V分析的流程 折疊

　　液相色譜分析由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測(cè)物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，

　　而ＨＰＬＣ改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在*條件下得以分離。

　?。ǘ┮合嗌V分析的分離過(guò)程

　　液相色譜分析同其他色譜過(guò)程一樣，ＨＰＬＣ也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過(guò)程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。

　　開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有３個(gè)組分，Ａ、Ｂ和Ｃ，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分Ａ不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分Ｃ 在固定相上滯留時(shí)間長(zhǎng)，較晚流出色譜柱。組分Ｂ的分配系數(shù)介于Ａ，Ｃ之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。

　　不同組分在色譜過(guò)程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問(wèn)題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(zhǎng)展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。液相色譜分析所以分離zui終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。

　　液相色譜儀的操作步驟如下：

　　1. 過(guò)濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。

　　2. 對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。

　　3. 打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測(cè)系統(tǒng)。

　　4進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動(dòng)菜單。

　　5. 有一段時(shí)間沒(méi)用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge，再點(diǎn)擊start，沖洗時(shí)速度不要超過(guò)10?ml/min。

　　6. 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過(guò)2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on，走基線，觀察基線的情況。

　　7. 設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file，選取select?users?and?methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊new?method。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測(cè)器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同的樣品而不同。

　　8. 進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過(guò)濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，液相色譜分析再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。

　　9 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜